Mutabilité de l'ADN (3)

Mesure du taux de mutation

 

Le système lacI d’E. Coli :

 

LacI code pour le répresseur (protéine qui se fixe sur l’opéron) de l’opéron lactose d’E.C.

En absence de lactose, le répresseur se lie sur l’opérateur est empêche l’ARN polymérase d’atteindre le site d’initiation de transcription.

L’ARN polycistronique n’est pas synthétisé

Il y a régulation négative de la transcription.

 

  

 

Distribution des mutations

 

Mutations qui donnent un codon stop (=mut.non-sens)

3 types de mutants non-sens :

UAG= codon ambre

UGA= codon opale

UAA=codon ocre

Différents composées augmentent le taux de mutations

 

 

 

 

Analyses des mutations

 

- taux de mutation : 10^-7 à 10^-10

- répartition non aléatoire (point chaud)

- La distribution des mutations spontanées et différente de la distribution des mutations induites

- Le profil de distribution est spécifique de l’agent mutagène : les mutations ne seront pas au même endroit ni a la même fréquence suivant l’agent utilisé)

 

Comment expliquer l’existence de mutation spontanée ?

       -Au cours de la division cellulaire, il y a des étapes de réplication, l’ARN poly peut placer de mauvais nucléotide

       -La molécule d’ADN n’est pas si stable que ça sur le plan chimique.

 

Systèmes d’analyse chez les eucaryotes

 

Utilisation d'un vecteur navette pour l'analyse de mutations dans des cellules eucaryotes transfectées.

On maintient des cellules eucaryotes en culture et on focalise sur un gène, on le fait entrer dans la cellule euca grâce à une vecteur de clonage.

 

Vecteur de clonage :

-         soit se réplique en s’insérant dans la

 cellule hôte

-         soit la réplication du gène qu’il porte

 se fait indépendamment du génome, grâce

 à son ORI

 

 

Analyse de gènes eucaryotes mutés par amplification par PCR et séquençage.

Des cellules sont maintenues en culture dans un tube, elles sont traitées par des agents mutagènes qu’on veut utiliser.

Pour étudier les modifications qui ont eu lieu, on amplifie par PCR la région qui nous interesse= cDNA

 

 

 

 

 

 

Application de la technique DGGE* pour l'analyse de mutations dans le génome de cellules humaines.

 

Technique DGGE :

Electrophorèse dans un gel contenant un graciant d’un agent dénaturant

 

Au fur et à mesure qu’on descend dans le gel, la concentration en agent dénaturant augmente. L’agent dénaturant ouvre la double hélice.

 

Hétéroduplex : GT    AC

 

La concentration en agent dénaturant est suffisamment forte pour ouvrir la double hélice. De ce fait les appariements corrects AT ou CG sont plus durs à séparer qu’un hétéroduplex qu’il est facile de dénaturer. On aura donc les séquences mutantes dénaturées avant les séquences sauvages.

 

  

 

Utilisation d'animaux transgéniques pour l'analyse de mutations :

 

On traite un rat entier, on bricole le gène de la cellule œuf de façon a mettre de part et d’autre du gène à étudier, une courte séquence cos qui sont nécessaires pour l’empaquetage du virus.

On isole de DNA provenant de divers organes et on isole le gène qui nous intéresse. Le rat a bien sur était exposé à un agent mutagène.

Les phages résultants du gène isolés sont criblés pour détecter ceux qui ont une modification.

 

 

 

 

 

Les altérations de l’ADN

 

-         erreurs introduites lors de la réplication de l’ADN

-         lésions spontanées (instabilités chimique)

-         lésions induites :

Agents intracellulaires : métabolisme

Agents extracellulaires : irradiations, composition chimique

-         remaniement génétiques : recombinaisons, transposition

 

Toute altération conduira à une mutation si elle n’est pas réparée avant la phase réplicative qui suit sa formation.

 

 

Erreurs liées à la réplication de l’ADN

 

L’ADN poly n’est pas fidèle a 100%, il y a une erreur une fois sur 10 millions, soit sur 3 milliard de pb, de la cellulaire mère à la cellule fille, on ne trouve qu’une seule erreur en moyenne. La réparation a lieu avant ou après réplication.

 

 

 

 

 

-         Des ions métalliques ont un effet sur la fidélité de l’ADN pol du virus de la myéloblastose aviaire. Ils perturbent sa fidélité

-         Des agents intercalants (bromure d’éthidium) ont un effet sur l’ADN, ils ajoutent ou enlèvent des bases.

 

 

 

-         Il y a souvent des mutations liées à la matrice de l’ADN, quand par exemple on a des zones de types AAAAA  CCCC TTT GGGG, l’ADN poly à tendance à déraper, elle glisse et forme une boucle. Si elle n’est pas réparée, on a une séquence plus longue. Ceci explique les points chauds de mutations car la fréquence de mutation sont plus élevées dans ces zones la.

 

Exemples :

 

 

 

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